现在我要讲的是关于基因工程的全过程，里面有工具、步骤还有容易犯的错误。故事得从1973年讲起，当时在斯坦福大学的Cohen把质粒DNA第一次注入大肠杆菌里面，并且观察到了抗生素抗性表型。这就是基因工程诞生的标志。从那时起，人类就有能力把一个生物的基因片段放进另一个生物体内并且让它工作。 要做基因工程的话，有三样基本工具是少不了的。第一个是限制酶，它像剪刀一样能够识别双链DNA中的特定序列并在那个位置把磷酸二酯键切开。同一种限制酶只能识别一个特定的碱基序列，所以选择合适的限制酶非常重要。 第二个工具是DNA连接酶，它像针线一样能够把两个有相同黏性末端的DNA片段重新缝合起来。请注意这个DNA连接酶不需要模板，它只是缝合而不是复制。 第三个工具是运载体，这个东西就像运输车一样可以承载目标基因进入受体细胞。常用的运载体包括质粒、噬菌体还有动植物病毒等。一个合格的运载体必须要有启动子、终止子和标记基因这些“三件套”，还要有复制原点这个能自我复制的“车道”。 接下来我们来说一下基因工程的四个主要步骤。第一步是获取目标基因，你可以通过基因文库找到它们，也可以用PCR扩增来获得更多的目标基因，甚至直接在DNA合成仪上打印出来。 第二步是切割目标基因，在这里你需要用限制酶在两端剪去相同黏性末端。为了避免出现自连情况，可以同时使用两种不同的限制酶。 第三步是切割运载体，在这里也使用限制酶进行切割，最好和目标基因使用同一套酶，这样可以方便后面进行连接操作。 第四步就是把切割好的目标基因和运载体通过DNA连接酶进行缝合，并导入受体细胞内。 不过请注意一个细节：受体细胞成功接受目标基因后并不是工程成功了一半而已——最终成功还需要看目标基因能否表达出表型。 说到易错点和误区，这次我们列举了九个常见问题给大家参考。限制酶不是一种而是一类工具，并且高温、强酸强碱环境会让它们失去作用。 DNA工程里的载体其实是DNA分子，而细胞膜上的载体是蛋白质分子这两个东西别搞混了。 DNA连接酶并不需要模板它只会把黏性末端缝合起来。 工具和工具酶是不一样的概念前者还包括运载体等等。 不必强求切割后的两个片段使用同样一种酶进行切割只要黏性末端能够互补就可以用不同的酶来操作。 插入位点并不是随便找个地方插进去而是要落在启动子到终止子之间才行。 启动子和终止子其实是在DNA中存在的片段而起始密码子和终止密码子则是在RNA中存在的东西——所以它们不是一回事儿。 受体细胞成功接受外源DNA后并不是整个工程就完成了最终还是要看外源DNA有没有表现出功能来才算成功。 还有就是千万别切掉复制原点否则重组片段进入受体细胞后会迷失方向无法发挥作用。 最后我给大家总结一下选出最合适的限制酶有三个步骤： 看切点：选择位于目标基因两端的外切酶避开内部插进去的那种位置； 看载体：质粒上的限制位点最好与目标基因一致不要破坏标记基因还有启动终止区域； 防自连：如果担心出现环化或者随意连接情况可以同时使用两种不同限制酶只要黏性末端互补即可； 这些小技巧都记好了以后做实验就方便多了！