要弄清这两种CF荧光试剂的区别，首先得看它们各自的本质。把CF594染料连到卵清白蛋白上，就变成了CF594 Ovalbumin。这是一种发出强烈红光的探针，在波长590到595纳米时激发，615到620纳米时发射光。而CF568 Ovalbumin用的是CF568染料，这种染料颜色稍微偏橙黄一些，激发在562纳米，发射在583纳米，更适合在复杂的多色染色里做配角。 把它们做出来的过程基本差不多，都是用NHS酯活化的CF染料，去跟蛋白表面的赖氨酸残基反应。这一步要在pH 8.3的碳酸盐缓冲液里进行，通过形成稳定的酰胺键把荧光团固定住。通常一个蛋白上会挂上5到10个染料分子，既要保证亮度足够，又不能让蛋白变性。 至于用起来的时候会遇到什么问题，解决方法也不复杂。用CF594的时候容易出信号弱或者背景高的情况，解决的办法是别老是冻融，多涂点抗淬灭的封片剂。孵育的时间可以控制在10到60分钟，浓度在5到20微克每毫升之间都可以。如果还不行就检查一下显微镜滤光片是不是匹配激发和发射的波长。如果发现非特异性结合太多，就要多洗几次PBS，加2到10%的血清封闭一下。千万别去碰那些已经凋亡或坏死的细胞。 用CF568的时候如果发现信号太弱或者沉积太多，把染料浓度调低一点，把孵育时间缩短到5到10分钟就好。如果做酪胺信号放大实验时还觉得不够亮，那就用点新鲜配的双氧水试试。做多色成像时最怕串色，这时候最好选光谱不重叠的染料组合（比如CF488和CF568），每一轮反应后用0.01摩尔的盐酸把HRP灭活掉。 最后说说它们分别适合干什么。CF594因为红光亮堂，特别适合做细胞凋亡检测（比如用Annexin V-CF594标记磷脂酰丝氨酸），还有糖基化模式分析（比如用ConA-CF594标记α-甘露糖），甚至可以用在超分辨率成像里（像STED这种技术）。CF568因为颜色不偏红不偏绿，很适合做多色成像（比如跟DAPI和FITC一起用），也能用来追踪内吞途径（比如用WGA-CF568标记糖蛋白），甚至在流式细胞术里做定量分析都很合适。 跟这两款产品有关系的试剂还不少，像Alexa Fluor 488到700的各种版本都有现成的。另外还有一些别的CF染料版本的卵清白蛋白，比如CF405、CF488A、CF633、CF640R这些都可以在市场上找到（本文内容由陕西新研博美生物科技有限公司木南整理）。