这次在实验室里进行PCR实验，我们碰到了好几个让人头疼的问题。头一个就是没有看到目标条带，这个真的挺折磨人的。你看电泳槽里面一排整齐的Loading Buffer，却完全找不到任何目标片段。不过别担心，引物质量很关键，先把这一对分子钳子换掉。GC含量保持在40%到60%之间，碱基数在19到23个之间，这样既能保证特异性又能兼顾效率。如果GC含量高，就减少碱基数；如果低的话，就增加一些。宁可稍微调整温度也不要硬扛引物问题。 第二个问题是出现了非特异性扩增，背景就像烟花一样炸开。模板浓度过高、引物特异性差或者枪杆残留微量污染都会导致这个问题。稀释模板、换枪头、戴新手套、用灭菌水这几招组合拳试试。如果还不管用，给PCR体系单独做个空管对照排查污染源吧。常见的污染源包括枪杆残留、外源核酸酶和水。要注意别用自来水做实验啊。 第三个问题是条带很弱，虽然看得见但是用起来不行。模板质量比你想象得要差一些：冻融次数别超过2次，4摄氏度存放别超过7天。第五天开始条带就会明显衰减，超过两天不处理DNA片段就像被酸雨腐蚀一样消失了。 第四个问题是低浓度目标需要用巢式PCR来放大。这个方法就是用第一回合扩增产物作为模板进行第二次扩增。这样就能把低浓度目标片段亮度提升1到2个数量级。 最后一个问题是如何保存产物呢？实验室默认规则是4摄氏度存放不超过24小时，超过48小时就有可能蒸发掉了。如果要隔夜实验直接胶回收比较安全。长期保存的话可以放在零下20摄氏度或者零下80摄氏度冻存管里哦。DNA在室温停留越久降解风险越高啊！