PCR实验出了岔子确实很让人头疼，这里咱们就把5个常见问题一次性盘个底朝天。首先是扩增出不来条带，这简直是实验室里最让人窒息的时刻。看着Loading Buffer 都亮堂堂地摆在那儿，却死活找不到目的带，真是让人绝望。这时候别乱折腾，先把那对“分子钳子”——引物换掉。记住选GC含量在40%到60%之间的，碱基数控制在19到23个碱基就行。要是GC含量太高就少放点碱基，太低就多加点。哪怕把温度调个5℃来微调也比硬扛着引物的短板强。 接下来是非特异性扩增导致的杂带满屏飞。这种情况多半是模板浓度太高或者引物不够专一，再加上枪头上残留了一点污染导致的。解决办法就是给模板稀释一下，换个新枪头再戴副新手套操作。如果这招不管用，那就把PCR体系单独做个空管对照查查看污染源到底在哪儿。常见的污染来源主要有三：枪杆上的上次吸液残留、操作过程中带来的外源核酸酶、还有普通自来水里带的RNA酶。这些东西哪怕是一点点肉眼看不见的滴溅都可能让整个实验白搭。 条带太弱看得到但用不了也挺让人着急。这时候别光顾着怪引物不行，看看模板是不是放太久了。冻融次数超过2次或者在4℃放了超过7天就很危险了。通常第5天起条带就开始肉眼可见地衰减，要是超过两天没处理好DNA就像被酸雨腐蚀了一样消失不见了。 当目的片段浓度太低没法测序的时候就得用上巢式PCR这种双重放大的手段了。“全内切”一对引物先做一轮扩增，再用这次的产物当模板进行第二轮扩增，目标亮度能瞬间提升1到2个数量级。如果想省点成本也可以只用一个嵌套引物做半巢式PCR，效果也不错还能省一半试剂费。 最后是产物保存的问题千万别大意。实验室的默认规矩是4℃保存不超过24小时就行。如果放了超过48小时那大概率就得报废了。如果是隔夜实验最好直接把产物胶回收出来再处理。要想长期保存最好赶紧转移到–20℃环境里去锁着冻存管里面锁起来最好室温停留得越久DNA降解的风险就越高。