做这个微生物分离与纯化的实验啊，用平板划线法就是为了把混杂的样品里目标菌给弄出来。简单说，就是利用接种环在固体培养基表面来回划拉，把微生物群体给打散了，让它最后形成一个一个孤立的单菌落，这样才能拿去鉴定或者保藏。 咱们来看看实验原理。刚开始先在边缘密密麻麻划一道，让菌均匀分布。接着呢，后面的区域都是从前面的末端取菌再划线，每次取的菌越来越少，到了最后一区就变成孤零零的一个小圈子了。 材料和试剂这块我就不展开了，重点说说操作步骤。咱们就按最常用的四区划线法来走。 第一步是准备工作。先把平板检查一下，别破了也别有水珠。要是有水珠啊，倒置个30分钟晾晾干就行。然后在底部用记号笔标上样品名字、日期还有操作者的名字，比如李四的土壤菌什么的。接着环境消毒也得做好，超净工作台或者酒精灯周围都要用75%的乙醇擦一遍，然后把紫外灯打开照个10分钟或者通风5分钟。 接下来是接种环灭菌。拿着环柄在酒精灯外焰上烧红大约3到5秒就好了。记住了啊，红热状态下停留久一点，把环端还有和环柄连着的地方都烧透才行。等自然冷却个10到15秒后触碰一下培养基边缘空白处看看有没有烫痕，如果烫得明显就得重新烧过。 冷却好的接种环就可以蘸取样品了。蘸的时候别贪心拿太多菌液或者土壤悬液哦，要不然第一区划得太密就没法看了。 开始分区划线吧！先左手拿着平板底部朝上打开一条小缝大概1厘米左右。右手拿着接种环从左下角开始以45度角划满四分之一区域的密密麻麻的线条（1到2毫米间距）。划完赶紧盖上盖子再把接种环烧红冷却。 接着是第二区（B区），从A区末尾的地方取一点点菌过来在右侧新的区域画垂直方向的线条。同样烧红冷却后再来下一区（C区），也是从B区末尾取菌继续垂直方向划第四分之一区域。 最后是第四区（D区），也就是从C区末尾取点菌在剩下的地方画稀疏的线条就好啦。这次画完不用再烧了直接扔掉或者用消毒液泡起来就行。 培养观察的话呢平板得倒过来放恒温箱里养着：细菌放37度养个18到24小时；真菌像酵母菌霉菌这些放28度养2到3天就行。 结果判断也很关键啊。成功的标志就是D区有形态一样的单个小圆圈儿菌落出现（直径0.5到3毫米）。失败的话可能是因为菌落太密重叠了（力度太大或者稀释不够），或者压根没长出来（样品没活菌、培养基坏了），还有就是操作过程中有杂菌混入（接种环没烧透或者平板开得时间太长）。 注意事项这块无菌操作最重要：全程在酒精灯旁边操作不能离太远；每次取菌或者划完都得烧红冷却再碰培养基；打开平板的缝要小一点防杂菌进去。 还有划线的技巧要注意别划破琼脂块；线条要均匀前面的末端菌量得够多；要是菌液浓度太高（OD600大于1.0），可以先用生理盐水稀释个10到100倍再划。 培养条件的话倒置培养防止水滴冲散菌落；厌氧菌要用专门的厌氧平板比如庖肉培养基然后放在厌氧罐里养。 安全跟废物处理也得注意：做完实验用75%乙醇擦台面；接种环用完了扔消毒液里泡着；污染的平板得高压灭菌121度20分钟再扔垃圾桶。 最后总结一下啊平板划线法就是微生物分离的核心手段，关键在于无菌操作加上一步步稀释。熟练了之后根据样品浓度可以调区数——比如三区法对付中度混杂的样品、五区法对付高度混杂的样品都能用得上。 这文章是环凯转载自“普西唐阮杭”公众号的仅供学习参考哈！